本发明涉及一种无血清、无饲养层培养多能干细胞的新方法，该方法稳定、可靠，能长期培养且维持多能干细胞的自我更新。本发明应用无血清无饲养层化学成分明确的培养体系对多能干细胞进行悬浮培养。培养15代后的干细胞的形态学、多能性标志分子的mRNA和蛋白表达，以及细胞染色质核型分析均表明，该类新培养体系能在长期培养过程中维持多能干细胞的特性。此外，本发明还通过体外拟胚体形成实验和体内畸胎瘤形成实验进一步验证了经15代悬浮培养后多能干细胞的分化潜能。