本发明公开了一种自组装间充质干细胞团块的制备、诱导分化及应用。间充质干细胞团块通过下述方法制备：1）在无菌条件下，使用水凝胶包被多孔培养板；2）将间充质干细胞扩增培养至第三代；3）用团块形成诱导液将第三代间充质干细胞制成细胞悬液，向包被的多孔培养板的每一孔中加入细胞悬液，使每一孔中细胞数量为1×10⁵～1×10⁶个，每天换团块形成诱导液一次，将多孔培养板置于细胞培养箱中培养，形成直径为500～600μm的间充质干细胞团块。本发明无需使用支架材料实现间充质干细胞的高密度三维培养，增加成软骨细胞诱导间充质干细胞的均一性，可直接应用于关节软骨缺损修复。