本发明提供一种脐血间充质干细胞的分离及培养方法，使用分离液对脐血单个核细胞进行二次分离后接种到预包被有纤连蛋白及CD90单克隆抗体的培养瓶中，使用无血清培养体系并模拟间充质干细胞体内低氧生长环境，经4-5天培养后移去悬浮细胞，继续培养贴壁细胞，待原代细胞融合率达到60%后进行传代培养。本发明提供的脐血间充质干细胞的分离及培养方法，有效解决了脐血间充质干细胞提取及培养过程中遇到的贴壁不牢、培养成功率低、纯度不高等问题，提高了临床应用的安全性。另外，本发明扩展了脐血间充质干细胞的应用范围，挖掘了脐血间充质干细胞的利用价值，开拓了脐血间充质干细胞的临床应用前景。