本发明涉及大鼠毛囊干细胞的分离培养方法，该方法包括以下步骤：1）选用一周龄SD大鼠触须部皮肤；用镊子和一次性注射器针头从皮下组织端拉出毛囊，收集形态完好且处于生长期的毛囊，显微镜下将毛囊切成三等份，取中间部分，PBS漂洗后放入50mL培养瓶中，加入DMEM/F12补充培养基，1周后毛囊隆突部有细胞爬出，形成克隆；2）培养条件为37℃、5%CO₂培养箱中，每2-3d换液一次；3）毛囊干细胞的传代消化条件为：TrypLE^TMExpress(1X)，no Phenol Red，37℃消化8-10min；4)毛囊干细胞的纯化。本发明由于采用了上述的技术方案，得到了理想的毛囊干细胞。