本发明涉及一种兽精原干细胞冻存液及其使用方法，属于干细胞生物工程领域。本发明公开的一种兽精原干细胞冻存液，它由基础液DMEM/F12、BSA、DMSO组成。一种兽精原干细胞冻存液的使用方法，将预冷冻存管和冻存液至4℃。收集兽精原干细胞，用冻存液稀释至每毫升含5×10⁴～1×10⁵个兽精原干细胞，4℃冷冻10～30min，-80℃冻存24h，投入液氮保存。本发明配制的冻存液成分简单，成本低，不含血清，用BSA取代血清，为兽精原干细胞的无血清培养提供了一个可靠的保存方法。