本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞库的构建方法。其方法是取人羊膜进行检测，用磷酸缓冲液冲洗涤后粉碎，加磷酸缓冲液稀释，用胰蛋白酶消化后，用胶原酶Ⅳ及脱氧核糖核酸酶Ⅰ消化，过滤制成单细胞悬液；再通过V_DMEM∶V_F12=1∶1DMEM／F12基础培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和亚硒酸钠，使人羊膜间充质干细胞在无血清条件下，置于培养箱中，换液和传代。将体外培养和扩增获得间充质干细胞置液氮冷冻，按新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。本发明具有无其他动物源性、来源广泛、不受伦理限制的特点。可提供间充质干细胞进行细胞治疗及其他应用。