本发明公开了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞，分选状态良好的人胚胎干细胞克隆团，接种于经丝裂霉素C处理过的人角膜基质成纤维细胞层上，培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞，加入培养瓶内，采用人角膜内皮细胞条件培养基置于37℃、5%CO2孵箱内孵育培养，隔天换液，培养10天左右，即得角膜内皮细胞，其增殖能力类似正常人角膜内皮细胞,体外最多能传1～2代，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。