本发明涉及Y-27632抑制剂在CD44阳性肠干细胞分选中的应用，其是以CD44作为标记分选肠干细胞。通过使用Y-27632抑制剂并结合使用磁珠分选CD44阳性细胞，从而使分离肠干细胞的方法更加便捷，操作更简单。本发明应用膜抗原对隐窝内的肠干细胞进行分选，不伤害细胞结构，而且，采用本发明的分离方法一次可获得充足数量的肠干细胞，为后续应用的开展奠定了物质基础。