本发明提供了一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法,包括无菌采集胎盘；分离绒毛膜组织；获取绒毛膜间充质干细胞；培养绒毛膜间充质干细胞；绒毛膜间充质干细胞的冻存；绒毛膜间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术效果：防范污染方法，从采集源头减少污染几率，多次冲洗表面，有效减少污染几率；减少混杂细胞污染；采用单一酶消化，可精简流程；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力，还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持端粒酶表达、癌基因稳定表达、核型稳定；酶消化和冻存复苏对细胞无伤害。