一种兽精原干细胞的分离方法，包括溶液配制和精原干细胞的分离，所述的溶液配制包括培养液、消化酶液、缓冲液、胶原溶液、明胶溶液、层粘蛋白溶液的配制，所述的精原干细胞的分离是将兽睾丸组织剪碎后加酶进行消化，细胞筛过滤后进行精原干细胞增殖培养，差异贴壁培养，最后收集精原干细胞，所述的差异贴壁培养包括胶原包被贴壁培养和层粘连蛋白包被贴壁培养，其特征在于：所述的培养液由DMEM/F12、FBS、丙酮酸钠、青霉素、链霉素组成；所述的胶原包被贴壁培养是将细胞培养至所需时间后吹打，然后继续培养。本发明在胶原包被贴壁培养过程中轻轻吹打，避免精原干细胞在胶原上贴壁，减少精原干细胞的丢失，提高了精原干细胞收率。