本发明涉及一种脂肪干细胞库的构建方法。脂肪干细胞库构建方法，包括以下步骤：（1）采集脂肪：对供者进行HLA分型检测、ABO/Rh血型、人源特定病毒、梅毒螺旋体感染的检测，然后在无菌场所采集脂肪；（2）冲洗脂肪组织，去除残留的血液，将脂肪组织绞碎为0.5～1mm³的脂肪组织微块；（3）收集脂肪组织微块，在700g离心10min；（4）吸弃下层液体，将脂肪组织微块用二甲基亚砜和血清替代品按照1:9的比例混合的冻存液重悬；（5）分装到冻存管中，放入冻存盒，-80℃冰箱过夜，次日转移到液氮保存；（6）按照供者HLA分型、ABO/Rh血型和性别进行保存，建立可供检索的细胞信息档案。本发明的脂肪干细胞库构建方法，简化操作步骤，减少人工干预错误，提高效率。