本发明涉及一种翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法，包括以下步骤，(1)精巢组织的收集：无菌条件下收集7月龄翘嘴红鲌精巢，用含有双抗的PBS中漂洗后碾压使精巢组织分散；(2)精原干细胞的消化、分离：向分散的精巢组织中添加0.1％IV型胶原酶，消化液离心得到沉淀；沉淀用0.25％胰蛋白酶消化；用含有10％FBS的培养基终止消化，收集细胞；(3)精原干细胞的原代培养：用含细胞因子的DMEM/F12完全培养基重悬步骤(2)所得的细胞，调整细胞浓度后铺于明胶包被的24孔细胞培养板中，26℃培养。本发明使得翘嘴红鲌精原干细胞原代细胞体外生长更容易增殖，为翘嘴红鲌生殖发育研究提供有效的细胞平台。