本发明公开了一种乳腺癌干细胞的培养方法，包括如下步骤：将获得单细胞状态的人乳腺癌细胞，加入含完全培养基中，制成细胞悬液；取对数生长期细胞悬液加入适量鲑鱼凝血酶，混合均匀后，等体积加入鲑鱼胶原蛋白原，得混合液；将混合液接种于超低粘附力的BME的96孔板内，36～38℃下保温，使其凝固成软凝胶；在软凝胶上方加入DMEM/F12培养液、1×B-27、上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和氢化可的松中培养7天，得乳腺癌干细胞微球。本发明使干细胞的分离更加稳定，实现有效扩增，直接获得乳腺癌干细胞微球，所得微球细胞为ESA⁺CD44⁺/CD24^-/low表型，明显具有肿瘤干细胞的特性。