本发明提出了建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用。分离间充质干细胞的方法，包括：A）利用胶原酶对动物样本进行消化，以便分散所述动物样本中所包含的细胞，以便获得包含干细胞的细胞混合物；B）将编码报告蛋白的核酸分子引入所述细胞混合物的至少一部分细胞中，其中，所述编码报告蛋白的核酸分子与间充质干细胞特异性启动子可操纵地相连，以便在间充质干细胞中表达所述报告蛋白；以及C）利用FACS，分选获得表达所述报告蛋白的间充质干细胞，其中，所述间充质干细胞呈单个细胞的形式。利用该方法能够有效地制备单个细胞形式的间充质干细胞。