本发明提出了一种乳腺癌干细胞的培养方法，属于细胞培养的领域。它包括以下步骤：（1）分析细胞分离所得乳腺癌干细胞球的CD44+CD24-乳腺癌干细胞纯度；（2）将CD44+CD24-乳腺癌干细胞纯度大于68%的乳腺癌干细胞球进行无血清非粘附扩增培养。与现有技术相比，本发明的有益效果是能保证干细胞只发生对称性分裂而不发生或少量发生分化，并且在不影响乳腺癌干细胞生长的情况下降低了培养费用。