本发明公开了一种间质干细胞体内突变肿瘤细胞株肺转移细胞株B6及其构建方法和应用，此细胞株采用大鼠骨髓间质干细胞体内突变肿瘤细胞株K3注射裸鼠胫骨骨髓腔致肺转移，将肺转移瘤体细胞分离原代培养获得的体外细胞，经过单克隆筛选，体外扩增后再进行致转移瘤，重复进行2轮筛选获得体内突变肿瘤细胞株K3肺转移细胞株B6。并通过一系列生物学鉴定方法鉴定体内突变肿瘤细胞株K3肺转移细胞株B6建立成功，相对体内突变肿瘤细胞株K3，肺转移细胞株B6具有更强的侵袭、转移、增殖、克隆形成能力，更具有肿瘤干细胞特性。K3体内突变肿瘤细胞株肺转移细胞株B6的建立为研究肿瘤干细胞生物学特性及寻找治疗肿瘤新途径提供研究基础，具有重要科研价值。