本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法及其应用。本发明提供一种体外扩增乳腺干细胞并维持其干细胞特性的方法，所述方法将乳腺管腔细胞与乳腺干细胞进行3D共培养，并在培养过程中加入雌性激素和/或孕激素。本发明中利用商品化的激素，通过刺激乳腺管腔细胞内源的Wnt4和Rspo1蛋白的表达以替代外源的Wnt3A蛋白，既达到了体外扩增乳腺干细胞的目的又降低了成本且容易操作和普及，且在体内移植实验中激素处理的实验组乳腺器官的重建成功率明显优于对照组。该模型建立后，可以应用于激素相关类药物的筛选，具有重要的应用意义。