本发明涉及干细胞领域，公开了一种乳牙牙髓干细胞的培养方法，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10-20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，加入细胞悬液重悬细胞并调整细胞密度，于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养，当细胞生长至80％-90％融合时，用含胰蛋白酶的消化液消化细胞后传代培养；其中所述细胞悬液由无血清培养基、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子组成。本发明所述培养方法培养的细胞形态良好，呈现梭形簇团性生长趋势；细胞活性高、增殖快，且能很好保持乳牙牙髓干细胞良好的干细胞特性，适用于乳牙牙髓干细胞的大量培养。