一种制备牙髓间充质干细胞及建立牙髓间充质干细胞库的方法及细胞复苏方法，它涉及一种制备干细胞库的方法及细胞复苏方法。本发明步骤如下：将牙齿的髓腔打开，经胰酶替代物半消化法对牙髓组织进行原代培养，经过传代培养即获得牙髓间充质干细胞，将制备的牙髓间充质干细胞进行生物特性检测，扩大培养，冻存，建立牙髓干细胞库。本发明采用了胰酶替代物半消化法对牙髓组织进行消化，这与传统的消化法不同，胰酶替代物价格便宜容易购买，半消化法有效防止了细胞的丢失，提高了细胞的冻存数量。本发明采用了牙齿作为制备间充质干细胞的组织材料来源，为储存牙间充质干细胞提供了机会。