本发明提供体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法，其是通过在体外维持、扩增、培养多能干细胞，在多能干细胞心肌分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细胞向心肌细胞分化的时期，向培养基中加入可直接或间接激活Smad1/5/8信号通路的物质，使干细胞定向分化为心室肌细胞。利用本发明方法，成功获得了具有生物学活性及功能的心室肌细胞，不仅揭示了心肌前体细胞向心室肌细胞分化过程中的调节机制，而且分化得到的人心室肌细胞对细胞移植治疗心肌梗死和心脏毒理分析及心脏相关药物的研发有广泛的应用。