本发明公开了一种诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞的培养方法，步骤如下：首先，采用DMEM/F12条件培养基培养人原代角膜缘干细胞，制备角膜缘干细胞条件培养基；然后，利用该角膜缘干细胞条件培养基联合IV型胶原体外培养诱导人胚胎干细胞定向分化为角膜缘干细胞。利用本发明的方法得到的角膜缘干细胞，经体外光学显微镜观察、电子显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光、流式细胞分析及克隆形成率测定等证实诱导细胞具有与正常角膜缘干细胞相似的形态和表型，并表现出良好的体外分化增殖能力，可体外传代4代以上，可以作为种子细胞用于制备角膜移植物。