本发明公开了一种大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株肿瘤干细胞样细胞的培养方法：1)取状态良好的对数生长期细胞；2)以10-30万细胞/ml培养基的比例接种于培养板内；3)间隔培养一天后，以4℃1000 rpm离心5min，弃一半上清液，重新加入等量的新干细胞培养基；4)干细胞培养2-3天后，培养基出现细胞碎片，继续隔天半量换液；5)培养一周，可见状态好的小细胞球出现；6)培养一周，待干细胞球初步形成，细胞增殖停滞；7)继续培养二周，使干细胞球基本形成。本发明从大鼠垂体泌乳素腺瘤细胞株中分离出来肿瘤干细胞样细胞，从而解决了肿瘤干细胞样细胞来源少的问题，能大量提供用于进一步研究。