本发明公开了一种干细胞小球诱导培养液及干细胞小球培养方法。属于细胞培养液。本发明是将原培养液培养的细胞生长至融合度达到90%，改用混合培养液培养，并在二氧化碳培养箱中第一次缺氧培养，直至90%的细胞发生死亡；剩余贴壁细胞经PBS洗涤加入原培养液继续培养增殖，待细胞密度达到90%后，重新更换混合培养液，并进行第二次缺氧培养，收集悬浮的干细胞小球。以此，在体外环境下诱导细胞连续不断产生大量干细胞小球，这些干细胞小球能表达明确的干细胞标志物：CD44，CD133，OCT3/4，Nanog，SOX-2和ABCG2等正常或者肿瘤干细胞标志物。