本发明公开了具有抗肿瘤活性的酰胺取代鬼臼类衍生物及其制备方法和用途。本发明将2-吡嗪羧酸、5-甲基-2-吡嗪羧酸、茶碱乙酸以及没食子酸与4′-去甲表鬼臼毒素进行酰胺取代反应，得到具有抗肿瘤活性的式(Ⅴ)所示的酰胺取代鬼臼类衍生物。本发明酰胺取代鬼臼类衍生物通过多途径、多靶点作用于肿瘤细胞，具有更好的抗肿瘤疗效。体外细胞活性抑制测试表明，本发明的酰胺取代鬼臼类衍生物具有优异的抗肿瘤活性、毒副作用低，能制备成抗肿瘤药物应用于临床抗肿瘤治疗。