本发明涉及一种灵芝孢子多糖、制备方法和应用，该灵芝孢子多糖是一种水溶性葡聚糖，分子量在700～10000Da范围内，其中分子量2000～4900Da的部分占60～85%。系用无机酸或有机酸溶液热处理灵芝孢子粉，减压蒸干溶剂，随后用水浸泡灵芝孢子粉，滤取浸泡液加入有机溶剂沉淀，沉淀用水溶解，离心取上清液浓缩干燥获得灵芝孢子多糖。该灵芝孢子多糖可以用于制备具有抗肿瘤和免疫增强功能的药物或保健品。