本发明提供一种从蛹虫草中提取抗肿瘤活性组分的方法：蛹虫草子实体超低温粉碎；得到超微粉水煮提取，沉淀再丙酮提取；得到沉淀溶解后过液相色谱，洗脱试剂为100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷、100%乙酸乙酯；选取活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂为100%正己烷、10%乙酸乙酯-正己烷、15%乙酸乙酯-正己烷、30%乙酸乙酯-正己烷、60%乙酸乙酯-正己烷；选取活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂为100%二氯甲烷、25%二氯甲烷-甲醇，选取活性最强组分过液相色谱，洗脱试剂为100%正己烷、5%乙醇-正己烷，选取活性最强组分即为本发明目的组分。该方法重复性好，得到的抗肿瘤活性组分可用于制备抗肿瘤药物中。