本发明公开了一种突变型细菌硝基还原酶基因及其应用，属于酶工程领域。根据多序列比对及蛋白结构分析，设计突变位点，以来自大肠杆菌的硝基还原酶NfsB基因为模板，采用重叠延伸PCR技术将NfsB基因第123位的苯丙氨酸(Phe)突变为丙氨酸(Ala)。突变后123位苯丙氨酸的空间位阻效应被解除，更有利于硝基类底物的结合和催化。本发明所述硝基还原酶突变体F123A具有硝基还原酶活性，与野生型硝基还原酶相比催化效率显著提高2-5倍。本发明所提供硝基还原酶突变体可广泛应用于药物激活及代谢、芳香羟胺合成及硝基污染物降解等诸多领域。