本发明属于药物化学领域，具体涉及一种采用D301大孔树脂分离纯化丙谷二肽的方法。将丙谷二肽粗品配制成质量分数5%～10%的水溶液；连续通过D301大孔树脂柱进行吸附分离，待流出液中检测到丙谷二肽时收集流出液；然后使用水淋洗D301大孔树脂柱，收集流出液；合并流出液，并浓缩；向浓缩液中滴加乙醇，析出晶体；过滤，得到的固体真空干燥，得到纯丙谷二肽粗品。本发采用物理方法，绿色环保；杂质都吸附在树脂中，减少乙醇析晶的使用量，同时也提高了产品的纯度，分离提纯后得到的丙谷二肽产品的纯度在99.6%以上，使用高效液相色谱检测发现无明显杂质；对丙谷二肽产品的损失率低，提高了收率，降低了生产成本。