本发明涉及一种三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用。具体地，提供了具有靶向肿瘤、促进穿膜和核定位三重功能的多肽，该多肽与两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺偶联形成的基因载体及其制备方法，该基因载体与DNA形成的复合物，以及上述具备三重功能的多肽和基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。本发明的基因载体体内转染效率高、细胞毒性低、靶向性强，具有广阔的临床应用前景。