本发明构建了一种耐阿德福韦酯乙型肝炎病毒（HBV）稳定复制表达细胞系，病毒来源于中国阿德福韦酯耐药慢乙肝患者，为我国流行的C基因型HBV株，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷酸类似物阿德福韦酯耐药突变位点。本发明通过筛选方法使病毒基因组整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞染色体上，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。病毒抗原分泌稳定，病毒DNA复制活跃，培养上清可检测到病毒颗粒，细胞核内具有稳定水平的HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）。该细胞系中的HBV复制对现有核苷（酸）类药物阿德福韦酯耐药，对拉米夫定、恩替卡韦和替诺福韦酯敏感。本发明的细胞系可为抗耐药HBV药物的评价及新药研发提供稳定可靠的细胞模型。