本发明公开了一种低免疫原性蚓激酶及其制备方法和应用，属于生物制药领域。本发明的方法包括首先从蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然后粗品通过离子交换柱进行洗脱，纯化，收集具有纤溶活性的组分，冷冻干燥浓缩，浓缩后的蚓激酶溶液用凝胶过滤色谱柱进行分离，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测纤溶活性，收集具有纤溶活性的第二个洗脱峰，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量为23500-27500Da，洗脱峰经透析脱盐低温冷冻干燥后采用活化的单甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐对其进行分子修饰，即得。通过本发明制备得到的蚓激酶具有免疫原性小，酶活力高等特点，能够用于抗血栓药物以及治疗或预防心脑血管疾病药物的研究和制备。