本发明公开了一种利福霉素类沃尼妙林杂合抗生素化合物及其制备方法。利福霉素类沃尼妙林杂合抗生素，具有式（Ⅰ）的结构。制备方法包括有以下步骤：1）在利福霉素s-钠盐的DMF溶液中，加入浓硫酸酸化0.5h，然后滴加二羟特丁胺，反应得到中间体恶嗪利福霉素Ⅱ；2）在质子性溶剂中将中间体恶嗪利福霉素Ⅱ与无水哌嗪混合，反应得到中间体3-甲酰利福霉素Ⅲ；3）将3-甲酰利福霉素和沃尼妙林在溶剂中混合溶解，氮气保护，15～30℃下搅拌2小时，冷却即可得到利福霉素类沃尼妙林杂合抗生素。将作用机制不同的两种药物分子连接起来，其结合方式与双重作用的药物前体相似，连接基团稳定，能起到非常好的治疗效果。